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制药工业中的生物催化

作者:N/A    | 发布时间:2015-06-06

由于具有反应条件温和、催化效率高和专一性强的优点,利用生物催化或生物转化等生物方法来生产药物的组分已成为当今生物技术研究的热点课题。继医药和农业之后,工业生物催化已经被认为是“生物技术的第三次浪潮”,其核心则是生物催化剂的使用和生产。生物催化剂主要有两种:全细胞和游离酶,两者的实质都是酶,但前者酶保留在细胞中,后者酶则已从细胞中分离纯化对于需要利用一种以上的酶和辅酶的复杂反应或酶不能游离使用的反应,通常采用全细胞的生物转化,否则为了简单起见则选择游离酶。据推测,自然界中约有25000种酶,其中已被认可的有300多种。根据酶催化的反应类型,可将酶分为六类:氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和联结酶。

在生产小分子的药物及中间体时,生物转化和传统的化学方法最显著的区别就是非常有效地不对称合成手性化合物。手性是生物体的基本特征,手性药物是指有药理活性的光学纯化合物,体内许多内源性化合物,包括与药物发生作用的天然大分子都具有手性。人体的手性环境可以识别手性药物对映体,使对映体的药代动力学和药理学出现差异,不同手性的药物作用于生物体时,它们所起的作用是不同的,在活性、代谢过程及毒性等方面存在显著差异。正是基于这一原因,开发单一对映体形式的合成药成为近几年的研究热点。

根据Technology Catalysts International(TCI)的统计,2000年,手性药物的销售额增加了13%,达到133亿美元,而且TCI预测,到2008年,这一数值有可能达到200亿美元,2000年,在市场上销售的所有药物中,有40%为单一对映体,而在1999年,仅三分之一为单一对映体[1]。生物催化剂还能合成经典的化学方法难以合成的非手性小分子化合物,此外酶还可用于生产大分子的化合物,如抗生素和有治疗作用的蛋白质。

1 生物催化剂的应用

目前异构酶和联结酶在这一领域的应用还较少,因此本文主要对氧化还原酶、转移酶、水解酶和裂解酶在制药工业中的应用状况进行综述。

1.1 氧化还原酶

氧化还原酶是一类催化物质进行氧化还原反应的酶类,被氧化的底物就是氢或电子供体,这类酶都需要辅助因子参与。据估计所有的生物转化过程涉及的生物催化剂有25%为氧化还原酶。根据受氢体的物质种类可将其分为4类:脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶和加氧酶。

1.1.1 脱氢酶

脱氢酶的受氢体绝大部分是尼克酰胺二核苷酸(磷酸),作为辅助因子的尼克酰胺核苷酸有两种:NAD+和NADP-。氧化还原反应在尼克酰胺环上进行,氧化状态时环上N为4价,写成NAD(P)+,还原后则写成NAD(P)H。脱氢酶是以辅酶或辅基为受氢体,所以又称为不需氧脱氢酶。Bommmarius等[2]利用亮氨酸脱氢酶,以不同的酮酸为底物合成了一系列手性氨基酸(见图1)。在这一方法中,辅助因子通过甲酸脱氢酶再生。


图1 脱氢酶催化酮酸化为手性氨基酸
Omapatrilat是血管紧张素转化酶和肽链内切酶的抑制剂,临床上可用于治疗高血压。L-6-羟基己氨酸是用于合成Omapatrilat的手性中间体,分别以氨基酸氧化酶和谷氨酸脱氢酶为催化剂,通过两步反应可将外消旋-6-羟基己氨酸转化为L-6-羟基己氨酸,转化率为97%,对应体过量(e,e值),大于98%(见图2)[3]。

1.1.2 氧化酶

氧化酶以氧分子为受氢体,所以又称为需氧脱氢酶。这类酶常需要黄素核苷酸(FMH或FAD)为辅酶,且结合紧密,故又称黄素蛋白。



图2 酶法合成L-6-羟基己氨酸

 

氨基酸氧化酶催化氨基酸转化为相应的酮酸,逆反应则由脱氢酶催化,例如以头孢菌素C为原料,二步酶法制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)(见图3)[4]。

阿昔洛韦是一种无环的鸟苷结构类似物,主要用于抑制单纯疱疹病毒I、II型及E-B病毒作用。黄嘌呤氧化酶能催化各种含氮杂环化合物的区域选择氧化。利用这一性质,能有效地将6-脱氧阿普洛韦氧化成阿昔洛韦(见图4)[5]。



图3 酶法制备7-氨基头孢烷酸



图4 酶法制备阿昔洛韦

1.1.3 过氧化物酶

过氧化物酶常以黄素FAD、血红素为辅基担负H2O2与过氧化物的分解与转化,催化以H2O2为氧化剂的氧化还原反应。佳息患是HIV-I蛋白酶抑制剂,临床上用于爱滋病的治疗。生产佳息患的一个关键中间体反-1S,2R-氨基茚醇能以手性的1S,2R-环氧茚为前体合成,而以Curvularia protuberate MF5400中的溴过氧化物酶和脱氢酶为催化剂,可直接将茚转化为1S,2R-环氧茚(见图5)[6]。

图5 酶法合成1S,2R-环氧茚

 

1.1.4 加氧酶

这类酶常伴随羟基形成,故又称为羟化酶。和氧化酶不同,它催化氧原子直接参入有机分子,可根据反应体系中氢供体数目分为两个亚类:单加氧酶和双加氧酶。

例如,在降血糖药物格列吡嗪(glipizide)的合成中,其中一个前体就是在生物催化剂的催化下,直接将甲基基团上的一个非活化碳直接氧化而成(见图6)[7]。


图6 酶法合成格列吡嗪的前体

 


内酯化合物是重要的手性构架。Stewart[8]等将Acinetobacter sp NCIB9871中的环己酮单加氧酶在面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)中进行表达,并以该酵母全细胞为催化剂催化不对称的拜尔-维利格氧化反应,合成了一系列的内酯化合物(见图7)。


图7 环己酮单加氧酶催化的不同对称的拜尔-维利格氧化反应

1.2 转移酶

转移酶能催化一种底物分子上的特定基团(例如酰基、糖基、氨基、磷酰基、甲基、醛基和羰基等)转移到另一种底物分子上,在很多场合,供体是一种辅助因子(辅酶),它是被转移基团的携带者,所以大部分转移酶需有辅酶的参与。在转移酶中,转氨酶是应用较多的一类酶。这类酶通常都需要磷酸砒哆醛为辅酶。磷酸砒哆醛是维生素B6的衍生物,它除了参与转氨基反应以外,也是脱羧反应以及消旋反应的辅酶。反应过程中先要形成活泼的西夫碱,然后再根据酶的催化特性进行相应的反应。转氨酶的特点是底物特异性低,反应速度快,已被用于大规模合成非天然氨基酸,以满足生产手性药物的需要[9]。L-同型苯丙氨酸是抗高血压药依那普利(enalapril)的组分。D-苯丙氨酸和L-叔丁亮氨酸分别是抗血栓药和抗爱滋病药的组分。

L-丝氨酸是一个重要的药用氨基酸。孙进等[10]利用丝氨酸羟甲基转移酶催化甲醛和甘氨酸,可逆地合成L-丝氨酸(见图8),反应过程中丝氨酸羟甲基转移酶需要PLP和四氢叶酸作为辅助因子。最终反应液中L-丝氨酸浓度达到0.2 mmol/L,该法是目前最有应用前景的L-丝氨酸生产方法。



图8 酶法合成L-丝氨酸

1.3 水解酶

水解酶是指在有水参加下,把大分子物质底物水解为小分子物质的酶,大多不可逆,一般不需要辅助因子。此类酶发现和应用数量日增,是目前应用最广的一种酶,据估计,生物转化利用的酶约三分之二为水解酶。在水解酶中,使用最多的是脂肪酶,其它还包括酯酶、蛋白酶、酰胺酶、腈水解酶、磷脂酶和环氧化物水解酶。由于脂肪酶较易获得,在已报道的生物转化过程约有30%与脂肪酶有关。常用的脂肪酶包括猪胰脂肪酶、假丝酵母属脂肪酶、假单孢杆菌属脂肪酶和毛霉属脂肪酶。例如用固定化脂肪酶合成抗高血压病药物地尔硫卓(diltiazem)的一个关键中间体(见图9)[11]。在这一过程中,目的产物的产率为40%~43%,光学纯度(e,e值)为100%。


图9 脂肪催化合成地尔硫卓的中间体


?酶法拆分也已广泛应用于制药工业。例如抗癌药物泰素(taxol,人工半合成紫杉醇)的β-氨基酯侧链就是用脂肪酶催化拆分外消旋氮杂环丁酮衍生物合成的(见图10)[12]。


图10 酶法制备泰素的β-氨基酯侧链

酰胺酶通常含有Zn2+,它们催化L-氨基酸酰胺的水解。例如用恶臭假单孢菌中的酰胺酶可以合成癫痫病附加治疗药哌啶酸的衍生物(见图11)[13]。

图11 酶法合成哌啶酸的衍生物

该拆分工艺的生产规模已达到吨以上(e,e值大于99%),而且副产物可通过动态拆分循环利用。另一个使用较广的酰胺酶是乙内酰胺酶,该酶常用于大规模制备D-氨基酸。例如用乙内酰胺酶工业化生产阿莫西林的侧链D-对羟基苯甘氨酸(见图12)[14],在该工艺中,非目的对映体可通过动态拆分循环利用。


 

图12 两步酶法合成D-对羟基苯甘氨酸

用磷酸化酶作为催化剂可制备天然和非天然的核苷。例如,用两步酶法合成抗病毒药利巴韦林(见图13)[15]。

图13 酶法合成抗病毒药利巴韦林

 

D-泛酸钙为维生素类药物,用D-泛解酸内酯水解酶将DL-泛解酸内酯拆分得到D-泛解酸内酯,再与β-丙氨酸钙缩合生产D-泛酸钙。该方法工艺简单,成本低,从环境角度考虑也有利[16]。

R-3-羟基4-腈丁酸乙酯是生产降胆固醇药阿妥伐他汀(Atorvastatin,商品名Lipitor)的中间体。在已报道的用2,3-二羟基氯丙烷合成该中间体的方法,需要6步反应,而用腈水解酶催化表氯醇合成该中间体只需3步反应(见图14)[17]。



图14 腈水解酶催化表氯醇合成R-3-羟基-4-腈丁酸乙酯

 

1.4 裂解酶

裂解酶催化小分子在不饱和键(C-C,C-N和C-O)上的加成或消除、裂解酶中的醛缩酶、转羟乙醛酶和氧腈酶3类酶在形成C—C时具有高度的立体选择性,因而日渐引起关注。用醛缩酶催化的醛缩反应可用于将醛的长度延长2个或3个碳单元。类似于化学醛缩反应,该反应可能是将一个稳定的带负电的碳加到醛上,并具有高度立体选择性。


例如用固定化醛缩酶合成N-乙酰神经氨酸已达到吨以上的规模(见图15)[18]。N-乙酰神经氨酸为神经氨酸苷酶抑制剂的前体,该抑制剂临床上用于治疗病毒性流感。

 


图15 酶法合成N-乙酰神经氨酸

多巴胺是哺乳动物中枢神经系统的神经传递质,也是激素降肾上腺素和肾上腺素的前体。临床上用于治疗急性循环系统不全和低血压。以3,4-二羟基-L-苯丙氨酸(L-DOPA)为底物,L-DOPA脱羧酶为催化剂可合成多巴胺(见图16)[19]。


 

图16 酶法合成多巴胺

在偶姻反应中成功的例子就是工业上用裂解酶制备L-麻黄素的前体(见图17)[20],此反应所用的酶为丙酮酸脱羧酶,该酶需用焦磷酸硫胺素(TPP)作为辅助因子。

 

图17 酶法合成L-麻黄素的前体

2 制药工业中生物催化剂的生产

由于酶制剂的生产需要筛选菌种,培育高产菌株,同时由于酶的保存和使用的环境有比较严格的要求,所以应用在大规模工业化上的酶并不是多见。其中目前大规模应用在制药行业中的有青霉素酰化酶、D-氨基酸氧化酶等。这些酶的固定化技术已经很成熟,我国在青霉素酰化酶的生产技术上已经跟西方国家大公司的相差无几,我国自行研发的来自枯草杆菌和巨大芽孢杆菌以及大肠杆菌的青霉素酰化酶早就在工业化大规模生产中使用,价格也被国内制药公司所接受。

在对映体选择性合成和官能团区域性选择转化过程中,酶是非常有用的工具。在有机合成中,生物转化适用的范围也较广。近年酶工程领域不断涌现许多新的技术,如抗体酶、人工合成酶、模拟酶、交联酶晶体等都是当今酶学研究领域的热点。此外利用基因工程技术、蛋白质工程技术改善原有酶的各种性能;运用基因工程技术将原来有害的、未经批准的微生物产生的酶的基因,或由生长缓慢的、动植物产生的酶的基因,克隆到安全的、生长迅速的、产量较高的微生物体内,改由微生物来生产。随着这些技术的发展与完善,未来必将会有更多的生物催化过程被应用于制药工业[21]。

收稿日期:2003-2-18

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